La clonación molecular se refiere al proceso de aislar una
secuencia de ADN, insertarlo en un plásmido y obtener múltiples copias de ella
en un organismo (generalmente procariota) por acción de la DNA polimerasa. La
clonación se emplea frecuentemente para amplificar fragmentos de ADN que
contienen genes, un paso esencial en el análisis subsecuente.
La clonación de cualquier secuencia de ADN incluye los siguientes pasos:
Fragmentación: Inicialmente, el ADN de interés necesita ser fragmentado para proveer un segmento relevante de ADN de un buen tamaño. La preparación de los fragmentos para la clonación se obtiene frecuentemente del PCR (reaccion en cadena de la polimerasa), pero también puede hacerse por medio de la digestión con enzimas de restricción y a veces fraccionando con electroforesis en gel.
Ligación: Un procedimiento de ligación se emplea cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector. Dicho vector (que generalmente es circular) se convierte en una secuencia lineal utilizando enzimas de restricción, y es incubado con el fragmento de interés bajo las condiciones apropiadas con una enzima llamada ADN ligasa.
Transfección: Después de la ligación, el vector con el gen de interés se transfecta a una célula. Comúnmente se utiliza la electroporación, aunque existe un gran número de técnicas alternativas.
Selección: Las células transfectadas se cultivan. Como este procedimiento actualmente se considera de baja eficiencia, se deben identificar las colonias de células que han sido exitosamente transfectadas con el vector que contiene el gen deseado.
No hay comentarios:
Publicar un comentario